Исследование морфологических характеристик митохондрий методами сканирующей зондовой микроскопии

Цель работы — провести анализ морфологических характеристик митохондрий методами сканирующей зондовой микроскопии. Разработать методы выделения митохондрий, их фиксации. Выбрать наиболее качественный вариант фиксации митохондрий на подложки и/или покровные стекла.  

Приоритетным направлением развития генной инженерии и биомедицины является исследование человеческих клеток. Исследование митохондрий способствуют разработке новых стратегий лечения заболеваний, характеризующихся митохондриальной дисфункцией. Понимание связей с клеточным циклом и апоптозом (клеточная смерть) обеспечит новые концепции в лечении рака, а также сделает более эффективным лечение митохондриальных заболеваний.

Существуют различные методы исследования митохондрий, наиболее подходящим является метод сканирующей зондовой микроскопии. Обусловлено это тем, что митохондрия имеет малые размеры, тем самым, исследование этих органелл методами оптической микроскопии является невозможным. Был проведён анализ существующих методов исследования митохондрий и их морфологии. В качестве оптимального метода выбран метод сканирующей зондовой микроскопии.

Проведены испытания экспериментальных образцов митохондрий, осажденных на подложку. Была разработана новая методика выделения митохондрий из клеток, исследованы раковые и здоровые митохондрии и их отличительные признаки. Область применения — биомедицина, генная инженерия.

Реферат. 3

Введение. 4

Глава 1. Современные методы сканирующей зондовой микроскопии для          изучения свойств биологических объектов – митохондрий. 6

1.1 Анализ морфологии митохондрий. 6

1.2 Исследование вольтамперных характеристик митохондрий. 10

1.2.1 Исследование мембранного потенциала митохондрий. 10

1.2.2 Исследование митохондриальных каналов. 13

1.3 Выводы.. 19

Глава 2. Материалы и методы, используемые для исследования морфологии митохондрий. 20

2.1 Методы сканирующей зондовой микроскопии. 20

2.1.1 Сканирующая туннельная микроскопия..................................... 20

2.1.2 Атомно-силовая микроскопия.................................................... 22

2.1.3 Электросиловая микроскопия. 23

2.1.4 Магнитно-силовая микроскопия................................................. 24

2.1.5 Ближнепольная оптическая микроскопия.................................. 25

2.2 Методы выделения митохондрий. 26

2.3 Методы осаждения и фиксации митохондрий. 27

2.4 Анализ полученных образцов с помощью спектроскопии. 29

2.5 Выводы.. 30

Глава 3. Исследование морфологии митохондрий. 32

3.1 Исследование морфологии митохондрий легкого человека. 32

3.2 Исследование морфологии раковых митохондрий легкого человека. 37

3.3 Исследование морфологии митохондрий печени человека. 41

3.4 Исследование морфологии раковых митохондрий печени человека. 42

3.5 Исследование морфологии митохондрий сердечной мышцы карпа. 45

3.6 Выводы.. 51

Заключение. 54

Список использованных сокращений. 56

Список использованной литературы.. 57

1.    Национальная технологическая инициатива - https://nti2035.ru/

2.    Центр НТИ «Сенсорика» - https://www.miet.ru/structure/s/3076

3.    Bertoni–Freddari C., Fattoretti P., Casoli T., Stefano G., Solazzi M., Perna M. Reactive structural dynamics of synaptic mitochondria in ischemic delayed neuronal death // Ann N Y Acad Sci. – 2006. – Vol. 1090. – P. 26 – 34.

4.    Bertoni-Freddari C., Fattoretti P., Giorgetti B., Grossi Y., Balietti M., Casol T., Stefano G., Perretta G. Synaptic and mitochondrial morphometry provides structural correlates of successful brain aging. // Ann N Y Acad Sci. – 2007. – Vol.1097. – P. 51–53.

5.    Madhavi C., Jacob M. Morphometry of mitochondria in the choroidal ependyma of hydrocephalic guineapigs // Indian J Med Res. – 1992. – Vol. 96. – P. 72–77.

6.    Cha H., Huang T., Chiu P., Charoenkwan E., Hwang S. An automatic neuronal morphology quantification method and its application in pharmacological discovery // BMC Bioinformatics. – 2011. – Vol. 12. – P. 1–18.

7.    Мыцик А. В., Степанов С. С., Ларионов П. М., Акулинин В. А. Актуальные проблемы изучения структурно-функционального состояния нейронов коры большого мозга человека в постишемическом периоде // Журнал анатомии и гистопатологиии

8.    Picard M., White K., Turnbull D. M. Mitochondrial morphology, topology, and membrane interactions in skeletal muscle: a quantitative three-dimensional electron microscopy study // Journal of Applied Physiology. – 2013. – Vol. 114. P. 161 – 171.

9.    Picard M., Taivassalo T., Gouspillou G., Hepple R. T. Mitochondria: isolation, structure and function // The Journal of Physiology. – 2011. – Vol. 589. P. 4413 –4421.

10. O'Shea P., Petrone G., Casey R., Azzi A. The current-voltage relationships of liposomes and mitochondria // The biochemical journal. – 1984. - Vol. 219. – P. 719 – 726.

11. Lemeshko V. The mitochondrial outer membrane in the control of cell energy metabolism // Ciencias biomedicas. - 2018. – Vol. 42. – P. 389 - 414.

12. Weifu L. J. Mitochondria and neuronal activity // Nature. – 2020. – Vol. 30. – P. 297 - 321.

13. Momcilovic M., Jones A., Bailey S., Waldmann C., Li R., Lee J., Abdelhady G., Gomez A., Holloway T., Schmid E., Stout D., Fishbein M., Stiles L., Dabir D., Dubinett S., Christofk H., Shirihai O., Koehler C., Sadeghi S., Shackelford D. // Nature. – 2019. – Vol. 52. – P. 380 – 384.

14. Crowley C., Christensen M. E., Waterhouse N. J. Measuring Mitochondrial Transmembrane Potential by TMRE Staining // Cold Spring Harbor Protocols. – 2016. – Vol. 49. P. 1092 – 1096.

15. Rostovtseva T. K., Kazemi N., Weinrich M., Bezrukov S. M. Voltage Gating of VDAC Is Regulated by Nonlamellar Lipids of Mitochondrial Membranes // Journal of Biological Chemistry. – 2006. – Vol. 281. – P. 37496 – 37506.

16. Paggio A., Checchetto V., Campo A., Menabò A., Marco1 G. , Fabio L., Szabo I., Rizzuto R., Stefani1 D. Molecular Basis for Mitochondrial Signaling. // Nature. – 2017. – Vol. 198. – P. 217 - 250.

17. Shoshan-Barmatz V., Ben-Hail D., Admoni L., Krelin Y., Tripathi S. The mitochondrial voltage-dependent anion channel 1 in tumor cells. // Nature. – 2015. – Vol. 39. – P. 2547 – 2575.

18. Rajeev G., Subhendu G. // Putative roles of mitochondrial Voltage-Dependent Anion Channel, Bcl-2 family proteins and c-Jun N-terminal Kinases in ischemic stroke associated apoptosis. – 2017. – Vol. 4. – P. 47 – 55.

19. Heit B., Yeung T., Grinstein S. Changes in mitochondrial surface charge mediate recruitment of signaling molecules during apoptosis. // American Journal of Physiology-Cell Physiology. – 2011. – Vol. 300. P. 33 – 41.

20. Heidrich H., Roland S., Hannig K. THE SURFACE CHARGE OF RAT LIVER MITOCHONDRIA AND THEIR MEMBRANES: Clarification of Some Controversies Concerning Mitochondrial Structure // Cell boil. – 1970. – Vol. 46. P. 137 – 150.

21. Rostovtseva T., Colombini M. ATP Flux Is Controlled by a Voltage-gated Channel from the Mitochondrial Outer Membrane. // Journal of Biological Chemistry. – 1996. – Vol. 271. P. 28006 - 28008.

22. Tewari D., Bera A. K. Modulation of the voltage-dependent anion channel of mitochondria by elaidic acid // Biochemical and Biophysical Research Communications. – 2016. – Vol. 477. P. 490 – 494.

23. Picard M., White K., Turnbull D. M. Mitochondrial morphology, topology, and membrane interactions in skeletal muscle: a quantitative three-dimensional electron microscopy study // Journal of Applied Physiology. – 2013. – Vol. 114. P. 161 – 171.

24. Maldonado E. N., Lemasters J. J. Warburg Revisited: Regulation of Mitochondrial Metabolism by Voltage-Dependent Anion Channels in Cancer Cells // Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. – 2012. - Vol. 342. P. 637–641.

25. Vincent A. E., Turnbull D. M., Eisner V., Hajnóczky G., Picard M. Mitochondrial Nanotunnels // Trends in Cell Biology. – 2017. - Vol. 27. P. 787–799.

26. Wang C., Du W., Su Q. P., Zhu M., Feng P., Li Y., Yu L. Dynamic tabulation of mitochondria drives mitochondrial network formation // Cell Research. – 2015. - Vol. 35. P. 1108–1120.

27. Егорова С.В., Афанасьев Е.А. Выделение митохондрий из клеток и тканей животных и человека: современные методические приемы // Сибирский медицинский журнал. – 2011. – Том 26. - №3. – C. 22–28.

28. Дрозд Е.С., Чижик С.А., Константинова E.Э. Атомно-силовая микроскопия структурно-механических свойств мембран эритроцитов // Российский журнал биомеханики. – 2009. - Том 13. - № 4. – С. 22–30.

29. Зорова А., Любава Д., Попков М., Василий А., Плотников К., Егор Ю., Силачев К., Денис Н., Певзнер Н., Ирина Б., Янкаускас Г., Станиславас С.; Бабенко Г., Валентина А.; Зоров К., Савва Д., Балакирева О., Анастасия В., Юхасова Р. Мембранный потенциал митохондрий // Аналитическая биохимия. – 2017. – Том 10. – С. 56 - 78.

30. Chen L. B. Mitochondrias potencial // Biology. – 2013. - Vol. 35. P. 110–119.

31. Erjavec K., Nikoella W. Raman spectroscopy as a tool for detecting mitochondrial fitness // Journal of Raman Spectroscopy. – 2018. – Vol. 2. P. 11-15.

32. Aravamudan S., Bharathi J., Thompson L., Michael A., Pabelick D. Mitochondria in lung diseases // Expert Review of Respiratory Medicine. – 2013. – Vol. 13. P. 631–646.

33. Preston T. J., Abadi A., Wilson L. Mitochondrial contributions to cancer cell physiology, potential for drug development // Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. – 2017. – Vol. 23. P. 892- 911.

34. Alirol E., Martinou J. C. Mitochondria and cancer: is there a morphological connection? // Oncogene. – 2006. – Vol. 15. P. 230-248.

35. Salvador‐Gallego K., Mund M., Cosentino K. Bax assembly into rings and arcs in apoptotic mitochondria is linked to membrane pores // The EMBO Journal. – 2016. – Vol. 18. P. 145-159.

36. Bachurin S., Shevtsova E. Mitochondria as a Target for Neurotoxins and Neuroprotective Agents // Biology. – 2008. Vol. 29. P. 234-249.

37. Bernardi P. Mitochondrial transport of cations: channels, exchangers, and permeability transition // Physiol. - 1999. Vol. 79. P. 1127–1155.